Práctica 7. Separación de una mezcla de aminoácidos por cromatografía en capa fina 24/10/2019

OBJETIVOS

El objetivo de esta práctica es aprender la utilidad y cómo realizar una cromatografía en capa fina. Realizamos una separación e identificación de los aminoácidos triptófano, alanina, valina y arginina presentes en una muestra mediante una cromatografía de capa fina ascendente.

Uno de los problemas más comunes en los estudios o análisis bioquímicos consiste en separar los componentes de una mezcla y, opcionalmente, identificar dichos componentes. La cromatografía permite realizar dicha separación e identificación.
Uno de los análisis empleados para la detección de aminoácidos en una muestra biológica es la cromatografía en capa fina.

Esta cromatografía es una técnica de separación e identificación de sustancias químicas disueltas en un disolvente que se mueve sobre una capa delgada de un adsorbente idóneo (fase estacionaria).
La fase estacionaria está dispuesta en una fina lámina que estár ecubriendo un soporte de vidrio o plástico. El material empleado en la fase estacionaria depende del tipo de muestras a separar. Para separar aminoácidos se utilizan gel de sílice, alúmina, almidón y geles de celulosa. La fase móvil también depende del tipo de moléculas a separar, utilizándose disolventes o mezclas de disolvente de diferente polaridad.
Las muestras se aplican en un extremo de la lámina de gel. A continuación, se coloca la lámina en posición vertical sobre un disolvente apropiado que ascenderá por capilaridad arrastrando las muestras. Las molçeculas que se han separado y ocupan diferentes posiciones, pueden ser observadas utilizando un revelador que las coloree.

Disolvente de cromatografía.
Disolución reveladora: 0,2 g de ninhidrina en 100 mL de acetona (caduca a los 6 meses).

Colocamos el disolvente de cromatografía en el vaso de cristal, de forma que cubra el fondo hsata una altura máxima de 1 cm y cerrarla.
Cogemos una placa de gel de celulosa de 10 x 5 cm. Con un lápiz marcamos los puntos donde se aplicarán las muestras. Estos puntos deben estar a 1,5 cm de la base y separados entre sí 1 cm.
Con la placa en posición horizontal, aplicamos 2 μL de la muestra y patrones de aminoácidos apoyando suavemente la punta de la micropipeta sobre el punto.
Una vez que las manchas se hayan secado al aire, introducimos la placa verticalmente en la cubeta de forma que las muestras queden en la base de la cubeta. Es muy importante que los puntos de aplicación queden por encima del nivel del disolvente. Ponemos la tapa y dejamos que el disolvente suba por capilaridad durante unos 40 minutos.
Sacamos la placa de la cubeta, marcamos con un lápiz el frente del disolvente y secamos la placa en la estufa.
Con la placa seca y el posición vertical, la pulverizamos con el revelador de ninhidrina. Es importante evitar el exceso de pulverización.
Volvemos a meter la placa en la estufa para que se seque. Al terminar, las manchas de los aminoácidos de color rosáceo aparecerán distribuidas a lo largo del gel.

En cada patrón de aminoácido obtendremos una mancha característica. En la mezcla problema, obtendremos tantas manchas como aminoácidos existan en ella. La posición de los patrones nos ayudará a identificar los aminoácidos de la muestra.
Podemos identificar dichos aminoácidos mediante un parámetro cromatográfico denominado relación al frente del disolvente.
Obtenemos que la muestra problema contiene ácido glutámico, ya que se sale del rango de valores.