Práctica 10. Identificación y cuantificación de proteínas plasmáticas en suero 27/11/2019

OBJETIVOS

  • El objetivo de esta práctica es identificar y cuantificar proteínas plasmáticas en el suero problema realizando una electroforesis.

UTILIDAD CLÍNICA

  • Como consecuencia de esta migración, se obtienen cinco fracciones correspondientes a diferentes proteínas plasmáticas con carga negativa decreciente:
    • Albúmina.
    • Alfa1-globulinas.
    • Alfa2-globulinas.
    • Beta-globulinas.
    • Gamma-globulinas.

FUNDAMENTOS

  • Las proteínas, moléculas anfóteras, en medio básico adquieren una carga global negativa quue hace que migren del cátodo hacia el ánodo cuando son sometidas a un proceso electroforético.
  • Como consecuencia de esta migración, se obtienen habitualmente cinco fracciones correspondientes a diferentes proteínas plasmáticas con carga negativa decreciente:

MATERIALES
Cubeta electroforesis
Fuente alimentación
Soporte
Láminas Mylar
Apliacador

REACTIVOS
Rojo Ponceau
Tris Hippurate 8.8
solución transparentadora
Metanol para las cintas reactivas y Tris Hipurato

MUESTRA
Suero

PROCEDIMIENTO

  1. Preparamos el buffer para técnica semimicro: tomamos 100 m de Tris Hipurato concentrado para 1000 ml de agua destilada.
  2. Preparamos el decolorante: disolvemos un sobre de ácido cítrico en polvo en 1000 ml de agua destilada. El decolorante está listo para usar cuando todo el material se ha disuelto.
  3. Equilibrado de las tiras: introducimos las tiras en 100 ml de buffer. Utilizamos un agitador rotativo durante 10-15 minutos.
  4. Preparamos la cámara de electroforesis: llenamos completamente un compartimento de la cámara de electroforesis. La inclinamos para igualar el nivel en ambos compartimentos.
  5. Seleccionamos la muestra: utilizamos suero fresco. Evitamos plasma que el fibrinógeno puede crear errores de interpretación en la zona de las gammaglobulinas.
  6. Secamos las tiras: colocamos las tiras impregnadas de buffer entre dos hojas de papel de filtro para retirar el exceso de tampón.
  7. Colocamos las tiras en el puente con la cara absorbente hacia arriba. Colocamos el puente en la cámara de electroforesis. 
  8. Aplicamos la muestra en la tira, utilizando un aplicador adecuado, durante 10 segundos. Tapamos la cámara de electroforesis.
  9. Conectamos la fuente de alimentación a 200 v durante 35 minutos. Desconectamos la fuente de alimentación y extraemos las tiras.
  10. Sumergimos las tiras en colorante Rojo Ponceau durante 5 minutos. Utilizamos un agitador rotativo. Recuperamos el colorante utilizado.
  11. Sumergimos las tiras en solución de ácido cítrico. Aplicamos 3 o 4 baños sucesivos hasta obtener un fondo blanco.
  12. Al finalizar el proceso de decoloración, surmegimos las tiras en el líquido transparentador durante 1 minuto. Utilizamos un agitador rotativo. 
  13. Colocamos la tira sobre la superficie de un Mylar film. Eliminamos el exceso de líquido con un rodillo. 
  14. Calentamos la tira a 80ºC en una estufa durante 10 minutos. Sacamos la tira y podemos proceder a su lectura en un fotodensitómetro.

RESULTADOS

  • Leemos la tira en el fotodensitómetro:



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