Práctica 11. Cuantificación de una proteína sanguínea por inmunodifusión radial

OBJETIVOS

• La inmunodifusión radial es una técnica cuantitativa muy sensible que se utiliza a menudo para detectar los niveles de determinadas proteínas sanguíneas de los pacientes.
• En esta práctica, vamos a determinar cuantitativamente una concentración desconocida de una proteína.

UTILIDAD CLÍNICA

• La reacción fundamental de la inmunología implica la interacción de anticuerpos y antígenos. Estas interacciones son útiles en la defensa del cuerpo contra infecciones bacterianas y virales y toxinas. Las capacidades de defensa dependen del reconocimiento de antígenos por componentes humorales del sistema inmunológico. 
• A continuación, se producen anticuerpos específicos en respuesta a la exposición al antígeno. La formación de complejos antígeno-anticuerpo es el primer paso para eliminar agentes infecciosos del cuerpo.

FUNDAMENTOS

• La RID es una técnica que puede determinar cuantitativamente la concentración de un antígeno. A diferencia de muchas técnicas de precipitación en gel y líquido que detectan cualitativamente el antígeno, el RID es una técnica cuantitativa sensible que se usa a menudo clínicamente para detectar niveles de proteínas sanguíneas en pacientes.
• El anticuerpo se incorpora en agarosa fundida que se vierte en una placa de Petri y se deja solidificar. Se cortan pocillos en la agarosa y se llevan con concentraciones conocidas de antígeno.
• Para cada antígeno se formará un anillo de precipitación de punto final de cierto diámetro. A partir de las concentraciones conocidas, se puede trazar una curva patrón.

MATERIALES

Placa Petri

Micropipeta

Puntas micropipeta

Tubos

REACTIVOS

PROCEDIMIENTO

• Preparación de la agarosa  y las placas con anticuerpos.

1. En un Erlenmeyer, añadimos todo el contenido del envase de Tampón en polvo a 200 ml de agua destilada. Agitamos la solución hasta que el polvo esté completamente disuelto.
2. Añadimos el contenido completo del paquete de agarosa a un matraz o vaso de precipitados que contenga 150 ml de tampón.
3. Enfriamos la solución de agarosa a 50ºC.
4. Vertemos 26 ml de solución de agarosa fundida en un tubo grande o en un matraz.
5. Añadimos el contenido completo de la Solución de anticuerpos a la solución de agarosa caliente de 26 ml.
6. Con una pipeta manual de 5 ml, dispensamos 2,5 ml en el fondo de cada placa de Petri, extendemos suavemente la agarosa con la pipeta para cubrir el fondo. Dejamos que la agarosa se solidifique.
   

• Preparación de antígenos.

1. Preparamos los siguientes tubos:
1. 1 tubo E + 75 μL de solución Ag estándar.
2. 1 tubo D + 10 μL de solución Ag desconocida.
3. 1 tubo T + 1 μL de tampón.
4. Preparamos una batería de dilución (1:2, 1:4, 1:8, 1:16).
   
   
   
   

• Carga de los patrones y la muestra.

1. Colocamos la plantilla debajo de la placa. Realizamos los pocillos utilizando el cortador de pocillos con un suave movimiento de perforación.
   
   
   
   
2. Cargamos los pocillos:
1. 5 μL de cada tubo en pocillos periféricos.
2. 5 μL de tubo D en pocillo central. 
   
3. Dejamos las placas en la cámara húmeda durante 48 horas.
   

RESULTADOS

• Los anillos de precipitina serán visibles en 48 horas. Con una regla, medimos el diámetro del anillo de precipitación en milímetros.
• Preparamos la curva de calibración con los resultados obtenidos:
  
  
  
  
• La concentración desconocida, con una medida de 144 mm, es aproximadamente: 0,56 mg/mL.