Práctica 12. Determinación cromatográfica HbA1c

OBJETIVOS

  • El objetivo de esta práctica es determinar cromatográfica-espectrofotométricamente la HbA1c en sangre utilizando un kit.

UTILIDAD CLÍNICA

  • Es muy importante realizar medicion es de HbA1c correctamente, ya que la prueba de hemoglobina glicosilada (HbA1c) es un examen de sangre para la diabetes tipo 2 y prediabetes. Mide el nivel promedio de glucosa o azúcar en la sangre durante los últimos tres meses. ... Un nivel de HbA1c normal es menor al 5,7 por ciento. La prediabetes se ubica entre 5,7 a 6,4 por ciento.

FUNDAMENTOS

  • Mezclando una alícuota de sangre completa con un agente hemolizante, se obtiene la lisis de los hematíes, la liberación de la hemoglobina contenida en ellos y la eliminación de la fracción lábil. La fracción A1c de la hemoglobina glicosilada es separada de la Hb A1A+B mediante cromatografía de intercambio catiónico.
  • El porcentaje de HbA1c se obtiene por comparación de la absorbancia del eluído con la absorbancia de la hemoglobina total.
  • El procedimiento no requiere ninguna calibración y puede realizarse en un rango de temperaturas de 20 a 28ºC.

MATERIALES
Columna cromatográfica
Micropipetas y puntas
Tubos
Eppendorf

REACTIVOS

MUESTRA

APARATOS

PROCEDIMIENTO

  • Preparación del hemolizado.

  1. Pipeteamos en un tubo:
    1. Tubo sangre: 50 μ.
    2. Tubo Reactivo 1: 450 μL. 
  2. Mezclamos vigorosamente e inbucamos a temperatura ambiente durante 15 minutos.

  • Separación cromatográfica.

  1. Quitamos el tapón superior de la columna y rompemos la respita inferior. Retiramos el líquido de la columna.
  2. Pipetamos en el interior de la columna 50 μL de hemolizado. Esperamos 3 minutos y descartamos el eluído.
  3. Pipeteamos en el interior de la columna 2 ml del reactivo 2 y descartamos el eluído.
  4. Colocamos la columna dentro de un tubo y pipeteamos 2 ml del reactivo 3 y recogemos el eluído.
  5. Mezclamos el eluído obtenido y leemos la absorbancia de la fracción A1c de la hemoglobina a 415 nm frente a agua destilada. Resultado: 0,146 A.

  • Preparación de la hemoglobina total.

  1. Pipeteamos en un tubo:
    1. 100 μL de hemolizado.
    2. 12 ml de agua destilada.
  2. Mezclamos y leemos la absorbancia de la hemoglobina total a 415 nm frente a agua destilada. Resultado: 0,921 A.

RESULTADOS

  • Debemos aplicar la fórmula: (A HbA1c) / (3 x A Hb Total) x 100 = % HbA1c.
  • (0,146) / (3 x 0,921) x 100 = 5,28%.
  • El rango normal se encuentra entre 4,2 y 6,2%.

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