Práctica 13. Inmunodotting para hepatitis autoinmunes

OBJETIVOS

• El objetivo de esta práctica esdetectar en suero humano anticuerpos de tipo G dirigidos contra unos antígenos específicos.

UTILIDAD CLÍNICA

• Esta prueba se realiza para comprobar la existencia de anticuerpos específicos para un tipo de antígeno de una muestra o suero.

FUNDAMENTOS

• Se basa en el principio del Enzimoinmunoanálisis. Cada tira del test está compuesta por una membrana fijada sobre un soporte plástico; en dicha membrana se han dispensado directamente los distintos Ag anteriormente mencionados. Si dichos sueros contienen los auto-Ac buscados, se unirán específicamente al correspondiente Ag de los fijados en la membrana. Mediante un lavado eliminaremos el exceso de Ac que no se han unido a sus Ag para, posteriormente, añadir un conjugado de origen caprino marcado con ALP. El conjugado se une a los complejos Ag-Ac. Después de realizar un segundo lavado con el fin de eliminar el exceso de conjugado, añade el sustrato que, por acción de la enzima ALP, desarrollará una coloración púrpura en el lugar correspondiente de la membrana. Dicha coloración tendrá una intensidad directamente proporcional a la cantidad de Ac presente en la muestra.

MATERIALES

Bandeja de incubación

Tiras dot

Micropipetas

Puntas micropipeta

REACTIVOS

MUESTRA

Suero

APARATOS

Agitador

PROCEDIMIENTO

1. Colocamos una tira en una cala de la bandeja de incubación con los puntos azules mirando hacia arriba.
   
2. Añadimos 2 ml de tampón de labado en cada canal usado. Incubamos 10 minutos en agitación. Tras una correcta incubación, los puntos azules de la tira desaparecen por completo.
   
3. Eliminamos el líquido de los canales invirtiendo lentamente la bandeja. Las tiras de adhieren al fondo de los canales.
   
4. Añadimos 1,5 ml de tampón de dilución en cada uno de los canales utilizados.
5. Añadimos 10 μL de muestra del paciente por canal. Incubamos 30 minutos en agitación. Debemos evitar tocar la membrana con las puntas de las pipetas.
6. Eliminamos el líquido de los canales invirtiendo lentamente la bandeja.
7. Lavamos dos veces cada canal utilizado durante 3 minutos cada vez. Después de cada lavado, eliminamos el líquido de los canales invirtiendo lentamente la bandeja.
8. Añadimos 2,5 ml de conjugado por canal utilizado. Incubamos 30 en agitación.
   
9. Eliminamos el líquido de los canales invirtiendo lentamente la bandeja.
10. Lavamos tres veces cada canal utilizado con 1,5 ml de tampón de lavado. Después, eliminamos el líquido de los canales invirtiendo lentamente la bandeja.
11. Añadimos 1,5 ml de sustrato por canal utilizado. Incubamos 10 minutos en agitación.
12. Eliminamos el líquido de los canales invirtiendo lentamente la bandeja. Las tiras se adhieren al fondo de los canales. Secamos el borde de la bandeja con papel absorbente.
13. Lavamos una vez más con 1,5 ml de tamopón de lavado.
14. Extraemos las tiras de los canales y las dejamos secar en papel absorbente.

RESULTADOS

• Despegamos la cubierta del adhesivo en la parte posterior de cada tira y colocamos dichas tiras con los puntos boca arriba junto a la hoja de interpretación.
• El punto superior debe aparecer coloreado en todos los pacientes. Sólo un punto de control de reacción claramente positiva asegura que los resultados son válidos.
• En condiciones óptimas, el control negativo será incoloro.
• Comparamos el punto correspondiente a cada antígeno específico con el punto de control negativo.